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胆囊癌（GC）作为一种恶性上皮性肿瘤，具有恶性程度高，发病少见但死亡率高等特点，由于该病早期无症状、起病隐匿、进展迅速，只有极少数患者能够在合适的时间接受手术治疗，尽管也有化疗、靶向疗法等其他治疗选择，但GC总体的预后较差。已经有研究表明、肿瘤细胞异质性、肿瘤微环境（TME）中的细胞构成、不同细胞类型间的相互作用等因素都可能影响胆囊癌的治疗效果。本研究利用BDRhapsodyTM单细胞平台，对原发性、淋巴结转移性肿瘤组织及邻近正常胆管组织中的肿瘤内异质性和TME细胞特征进行研究，希望能够提高对胆囊癌发生、发展机制的认识，为胆囊癌的研究和治疗提供新的思路。
研究方法研究结果1.人GC的单细胞RNA表达谱分析本研究对胆囊腺癌、胆囊腺鳞癌和胆囊神经内分泌肿瘤（NET）患者的、癌旁和淋巴结转移肿瘤组织进行了scRNA测序，共获得了个单细胞的转录组信息（图1A），共鉴定出10个不同的细胞群（图1B），这些细胞群在患者或病变部位呈现不均匀分布（图1C）。其中，CDH1+/EPCAM+上皮细胞在腺鳞癌和腺鳞状组织中富集，TNK淋巴细胞、B细胞和髓样细胞在上皮性GC肿瘤和相应的正常组织中表达丰富，包括RGS5+、PSOTN+和PDGFRA+成纤维细胞在内的基质细胞在原发性和淋巴结转移NET组织中富集（图1D），这些结果揭示了不同类型GC的肿瘤和TME异质性。图12.胆囊上皮性肿瘤细胞和NET细胞的异质性通过整合EPCAM+上皮细胞和NET细胞，确定了三个细胞簇（图2A、2B、2C）。通过竞争基因集富集分析（GSEA）进一步揭示了这些上皮细胞的异质性（图2D）。图2对来自SC患者肿瘤细胞的轨迹进行分析，发现晚期鳞状上皮肿瘤细胞（cellfate1）和早期腺上皮肿瘤细胞（cellfate2）的细胞分支转化连续（图3A）。对来自原发性和淋巴结转移组织的NET细胞进行轨迹分析，确定了五种细胞状态（图3C），这5种细胞状态在原发性和淋巴结转移性肿瘤中的比例不同（图3D）。不同细胞状态表现出的细胞能力不同，这些结果证明GC中恶性细胞的异质性和GC进展过程中细胞状态的动态变化（图3E、3F和3G）。图33.GC中TILS的不同亚群TNK淋巴细胞作为GC中丰富TME的细胞群（图1），可以进一步被注释为6个亚群（图4A、4B），包括NK、CD4-/CD8-T、CD8+T、CD4+/CXCL13+T辅助细胞（CD4+Th）、CD4+T-reg和na?veCD4+T细胞，而各亚群表现出的不同活性（图4C、4D、4E）表明各亚型间的细胞异质性。为了验证scRNA-seq结果，通过免疫组织化学染色（IHC）分析胆囊腺癌和邻近的正常组织，发现肿瘤组织中的CD4+和CD8A+细胞减少（图4F）。此外，通过免疫浸润分析进一步证实了scRNA-seq结果（图4G）。图44.GC组织中髓样细胞的不同亚群骨髓细胞在抗原呈递和炎症反应中起着重要作用。在GC中鉴定出骨髓细胞的单核细胞、中性粒细胞、树突状细胞（DC）和巨噬细胞等亚型（图5A）。最丰富的髓样巨噬细胞进一步被注释为四个不同的细胞组，包括CCL20hi/CDlo、CCL20lo/CDhi、APOE+和激活1型IFN巨噬细胞（T1-IFN）（图5B、5C）。与上皮性GC相比，NET肿瘤仅含有少量髓样细胞，主要是中性粒细胞和DC（图5D）。与邻近正常组织相比，肿瘤中的抗炎巨噬细胞（CCL20hi/CDhi和APOE+）增加，而促炎巨噬细胞（CCL20hi/CDlo）减少（图5D）。T1干扰素激活的巨噬细胞显示出与1型干扰素（IFN）反应相关的基因显著表达（图5C）。轨迹分析结果显示在GC中，CCL20hi/CDlo、CCL20lo/CDhi和T1-IFN巨噬细胞持续转变为APOE+巨噬细胞（图5E）。图55.GC中基质细胞重塑与血管生成增强在scRNA结果的10个细胞群中进一步分析三组基质细胞（RGS5+、PSOTN+和PDGFRA+成纤维细胞）（图6A）。发现原发性和淋巴结转移性肿瘤中PDGFRA+成纤维细胞的比例显著降低，而PSOTN+和RGS5+细胞与邻近正常组织相比显著增加（图6D），反映了肿瘤组织中细胞外基质的普遍重塑。内皮细胞聚类确定为KDR+（也称为VEGFR-2）和ACKR1+EC细胞的聚类。在个别患者的GC和正常组织中都发现了这两种细胞类型，并且在上皮GC组织中发现了ACKR1+ECs的轻微增加（图6H）。以上结果提示，间质和内皮细胞重塑可能对GC的血管生成具有促进作用。6.GC中的细胞间配体-受体相互作用构建起源特异性细胞通讯网络，证实了肿瘤细胞、免疫细胞和基质细胞之间的重要相互作用。其中，抗炎巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞之间的配体-受体相互作用最为显著（图6A-6C）。在原发性肿瘤组织中，肿瘤细胞和内皮细胞之间的细胞相互作用，特别是CXCL1/ACKR1和CXCL8/ACKR1作用增强（图6A-6D）。此外，在原发性和淋巴结转移组织中，通过ACKR1+ECs中的LGALS9及其在巨噬细胞中的受体，ACKR+ECs和抗炎巨噬细胞之间的相互作用显著增加（图6E），这可能有助于GC中巨噬细胞的聚集和状态转换。图6结论本研究揭示了在胆囊癌进展过程中多种细胞群的广泛重排，剖析了胆囊TME的细胞异质性和相互作用，为胆囊癌的治疗提供了潜在的靶点。
点击文章底部“阅读原文”免费技术咨询参考文献PeizhanChen,JingquanLi,HuiWang,etal.Diversityandintratumoralheterogeneityinhumangallbladdercancerprogressionrevealedbysingle-cellRNAsequencing.ClinicalandTranslationalMedicine().往期精彩推荐如何从冷冻脑组织中制备完整细胞核样品？WOLF有诀窍……DispendixI.DOT?——微型自动化scRNA文库制备好帮手NanoCellect重磅上市新一代流式细胞分选仪WOLFG2，极轻柔和多色分选兼得代理产品业务线雷英彤
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